Bioero

Aquí trataremos la solución a algunos problemas vinculados con la estabilidad plasmídica.

Muchos vectores derivan de plásmidos de control relajado. Los derivados de ColE1 tienen entre 15 a 60 copias. Para el caso de la serie pUC ésta llega a presentar varios cientos de copias por célula y los derivados p15A tienen aproximadamente unas 15 copias. En ausencia de presión selectiva se pierden plásmido en cada ciclo celular como resultado de multimerización. Sin embargo cuando se clonan genes cuyos productos son tóxicos u originan una gran carga metabólica para la célula húesped, o cuando las mismas se cultivan en fermentaciones en continuo a altas densidades las pérdidas suelen ser mucho mayores.

El uso de antibióticos para mantener la presión selectiva presenta ciertas desventajas, entre ellas, la contaminación del producto o la biomasa con el antibiótico. Para evitar estos efectos no deseados, se han diseñado algunas alternativas, como el uso de plásmidos que ocasionan la muerte celular cuando los mismos son eliminados de la célula. Sin embargo, este tipo de contrucciones génicas tienen el inconveniente de que introducen restricciones en el diseño de los medios de cultivo junto con una carga metabólica adicional. Por tal motivo, para evitar tales desventajas se ha diseñado otro sistema con las siguientes características:

1) Cepa huésped con un gen cromosómico condicionalmente esencial bajo el control del promotor-operador de lac
2) Un plásmido acompañante multicopia que lleva el operador de lac
3) Secuestro mayoritario del represor LacI por los numerosos operadores de lac que origina la expresión del gen cromosómico (de resistencia a kanamicina) y el crecimiento selectivo de células portadoras del plásmido en medio con el antibiótico.

Es de destacar que en la mayoría de los casos es deseable y más rentable una producción no demasiado alta, aunque estable. Para lograr este objetivo se puede intentar recurrir a vectores con menos copias o a integración cromosómica.

Plásmidos de mediano número de copias

Este tipo de plásmidos tienen unas 5 a 20 copias por célula. Se han construido algunos vectores a partir de varios plásmidos naturales tales como:

RK2 (del grupo IncP). Este vector tiene amplio espectro, presenta un control estricto del número de copias, son autotransmisibles y presentan entre 10-15 copias por cromosoma.
Los miniplásmidos derivados de RK2 han mostrado ser estables durante 200 generaciones en algunas pseudomonas en ausencia de presión selectiva, pero pueden ser mucho menos estables en otras bacterias.

RSF1010 (grupo IncQ). Es un vector de amplio espectro, autotransmisibles y presentan unas 20 copias por célula.

Plásmidos de bajo número de copias

Este tipo de plásmidos tiene entre 1-5 copias por célula. Se ha construido un vector derivado de F, que presenta las siguientes características:

1) 9 kb de F con elementos necesarios para la replicación y la estabilidad segregacional con las siguientes características:

Los orígenes oriV, oriS aseguran replicación específica del ciclo celular,
El locus de reparto permite el reparto equitativo a células hijas,
El gen repD recombina los dímeros hasta monómeros y los genes ccd matan cualquier segregante que pierda el plásmido.

2) El Módulo de clonación para la expresión presenta:

Promotor de araBAD y gen araC para una expresión inducible por arabinosa. Sitio de clonación múltiple, presentando además terminadores de la transcripción.
Este plásmido tiene la ventaja que es estable en ausencia de presión selectiva, junto con una expresión génica bien controlada, imponiendo además una pequeña carga metabólica a la célula.

Integración cromosómica

A menudo es mejor intentar expresar el gen a clonar desde una localización estable en el cromosoma del huésped, evitando que se replique por medio de plásmidos. Una vez insertado en el cromosoma, el gen puede quedar en forma estable durante muchísimas generaciones sin necesidad de recurrir a presión selectiva.
Sin embargo, la integración debe lograrse en un sitio del cromosoma que no sea esencial. Para que el gen de interés se integre en determinado sitio del huésped, se debe realizar una construcción genética en la que el gen vaya unido a secuencias homólogas del huésped, con el objetivo de favorecer la recombinación en el cromosoma celular.
La metodología básica entonces sería la siguiente:

1. Hay que identificar un sitio adecuado para la integración; esto es, un sitio donde se sepa que “al romperlo” no va a afectar las funciones celulares normales.
2. Se debe aislar y clonar todo o parte de ese sitio cromosómico.
3. Se asocia al gen de interés que se desea producir, provisto de un promotor regulable, al sitio clonado para la integración. Esto se puede hacer básicamente de dos modos:
a. El gen de interés se inserta “dentro” del sitio de integración clonado, por lo que se tiene una construcción tipo “sandwich” de dos trozos del sitio de integración enmarcando al gen de interés.
b. Se inserta el gen de modo adyacente al ADN clonado de integración.
4. A continuación se transfiere la construcción genética a las células huéspedes. Para ello la construcción genética va formando parte de un plásmido que no puede replicarse en el huésped (vector “suicida”).
5. Se aplica la presión selectiva que permita recuperar y multiplicar los transformantes buscados. Obviamente, con estas condiciones, la propagación del gen clonado sólo tiene lugar si se ha integrado en el ADN cromosómico de las células.

Si se ha realizado la transformación usando un plásmido que lleva el gen interrumpiendo el sitio de integración clonado [caso a) de la fase 3) citada arriba], los dos segmentos separados de ADN del sitio de integración suministran sendos lugares de homología respecto del cromosoma, con lo que se puede producir un doble sobrecruzamiento que lleva a la integración del gen en cuestión.
Si por el contrario se ha transformado con el plásmido en el que el gen está adyacente al ADN clonado del sitio de integración (caso b), un simple sobrecruzamiento entre este y la región homóloga del cromosoma conducirá a la integración de todo el plásmido, incluyendo el gen de interés.

Otro método para lograr inserciones en lugares cromosómicos predeterminados es mediante un sistema en dos pasos que se ha ensayado con éxito en Bacillus subtilis. El mismo consiste básicamente en:

1. Insertar un gen marcador de resistencia a antibióticos en un lugar no esencial del cromosoma (empleando la lógica que se ha descrito más arriba, en la que el gen interrumpe secuencias del huésped previamente clonadas), y se selecciona los transformantes resistentes al antibiótico usado como marcador.
2. Luego transformar con un segundo plásmido “suicida” en el que se tiene el gen de interés interrumpiendo las mismas secuencias clonadas del huésped usadas en la fase 1). Un doble entrecruzamiento entre dichas secuencias y las homólogas del huésped elimina el gen marcador mientras que inserta el gen de interés.

Si se repite lo anterior, pero usando en cada caso secuencias clonadas diferentes del hospedador, lo que se obtendría es una cepa que lleva varias copias del gen en cuestión insertadas en diferentes lugares del cromosoma.