Bioero

Debido a que la clonación directa, o sea sin manipulación adicional de un gen en un vector normal sin modificación molecular, tal como el plásmido pBR322, no suele asegurar que el gen de interés se vaya a expresar correctamente ni en concentración adecuada, en particular cuando se procede a clonar genes de especies alejadas filogenéticamente, deben considerarse algunas características para el diseño de vectores adecuados.

A grandes rasgos debe tenerse en cuenta:

1- La naturaleza de las secuencias de inicio y final de la transcripción (promotores-operadores, terminadores).
2- Las señales para el comienzo de la traducción, especialmente sitios de unión del ribosoma y codón de inicio de la traducción.
3- La eficiciencia de la traducción, lo que puede incluso llevar a emplear codones sinónimos adaptados a la abundancia de los correspondientes ARNt del huésped.
4- La estabilidad de la proteína recombinante en la célula huésped.
5- La localización celular de la proteína a expresar ya que en muchos casos interesa que la proteína se secrete, por lo que el diseño genético debe incluir señales de procesamiento postraduccional adecuadas y sin embargo otras veces interesa que la proteína permanezca en el espacio periplásmico de la bacteria Gram-negativa huésped, o bien en el citoplasma.
6- El número de copias del gen clonado es otro factor a considerar muy importante. Cuando se pretende que el gen se exprese a alto nivel, se suele escoger un plásmido de control relajado, es decir, con gran número de copias, mientras que si interesa un nivel bajo de expresión se escoge un plásmido de control estricto, con poco número de copias, u otra alternativa plausible sería integrar el gen de interés en el cromosoma bacteriano.

Por tales motivos, cada vez que se desea clonar y expresar un gen, se debe ajustar específicamente muchos de estos parámetros, construyendo vectores de expresión ad hoc, escogiendo las cepas huéspedes, etc.

En tal sentido uno de los microorganismos huéspedes más usados en ingeniería genética es la bacteria Escherichia coli. Sin embargo, para muchos experimentos se debe recurrir a otros huéspedes, como la bacteria Bacillus subtilis, las levaduras Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris entre las más usadas, o incluso células de insectos o de mamífero.

Para el caso particular de los vectores de expresión en E. coli , deben los mismos tener determinadas características (se citan a continuación los elementos genéticos siguiendo el orden desde el extremo 5’ al extremo 3’ de la molécula de ADN):

1- Debe tener un promotor eficiente, dotado de las regiones conservadas –35 (TTGACA o similar) y –10 (TATAAT o similar).
2- A corta distancia del promotor, debe tener una región que al transcribirse suministre el sitio de entrada al ribosoma: la denominada secuencia de Shine-Dalgarno, que es complementaria del extremo 3’ del ARNr 16S.
3- A una distancia de entre 3-11 pb downstream de la secuencia de Shine-Dalgarno, debería situarse el codón ATG que señala el comienzo de la traduccción del ARNm. Este codón lo puede suministrar el gen a clonar, o bien el vector puede disponer de ese codón, seguido de alguna diana que permita la inserción del gen a expresar.
4- Finalmente, y situado al lado 3’ de todo lo anterior, es necesaria una secuencia que funcione como terminador de la transcripción (que en su forma de ARN constituye la típica horquilla por emparejamiento intracatenario, donde la ARN polimerasa se desliga del ARN recién formado).

Lecturas recomendadas:

Homologous high-throughput expression and purification of highly conserved E. coli proteins. Microb Cell Fact. 2007 Jun 6;6:18.

A family of E. coli expression vectors for laboratory scale and high throughput soluble protein production. BMC Biotechnol. 2006 Mar 1;6:12.

Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol Rev. 1996 Sep;60(3):512-38.